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给Cas9一个'on'开关,以更好地控制CRISPR基因编辑

信息来源:switchb2b.com  时间:2019-04-20  浏览次数:25

给Cas9一个'on'开关,以更好地控制CRISPR基因编辑

ProCas9可以检测到一种叫做蛋白酶的酶的存在。ProCas9(左,灰色)无效,直到蛋白酶剪断一小段蛋白质(红色环),此时它变得活跃(正确,红色)并结合DNA。通过使Cas9在结合DNA时发出荧光,研究人员得到了蛋白酶存在的信号。

CRISPR-Cas9是一种革命性的工具,部分原因在于其多功能性:由细菌产生的咀嚼病毒,它在人体细胞中同样有效地进行各种遗传技巧,包括切割和粘贴DNA,制造精确突变以及激活或灭活一个基因。

加利福尼亚大学伯克利分校的研究人员现在通过提供“开启”开关使其更加通用,允许用户在除指定目标之外的所有细胞中保持Cas9基因编辑器关闭。

经过重新设计的Cas9酶 - 研究人员称之为ProCas9 - 除了含有一定长度的蛋白质外需要在酶结合并切割DNA之前进行剪切。如果科学家插入一小段蛋白质,只能通过特定的酶切割,例如癌症细胞或感染性病毒或细菌专用的酶,那么这种酶就会成为开启Cas9的触发因素。

ProCas9基本上“感知”它所处的细胞类型,基于蛋白质切割酶 - 一种所谓的蛋白酶 - 存在。

加州大学伯克利分校和分子细胞生物学副教授大卫萨维奇说:“这是一个额外的安全层,可以放在分子上以确保准确切割。”

除了可编程输出外,它还赋予Cas9蛋白可编程输入。

“有很多蛋白酶调节细胞中的信号通路,将正常细胞转化为癌细胞,并参与病原体感染,”Savage说。“如果我们能够感知到这些信号,我们就可以利用并对这些重要途径作出相应的反应。”

在该研究中,Savage及其同事通过使Cas9对植物和人类病毒(如西尼罗河病毒)敏感来证明Cas9的蛋白酶控制。在未来,他们相信这种技术可用于将CRISPR-Cas9细菌免疫系统导入植物中,以帮助它们抵御病毒性病原体的破坏。

来自加州大学伯克利分校和旧金山格拉德斯通研究所的研究人员的研究将于1月10日在线发表在

Cell

杂志上。

给Cas9一个'on'开关,以更好地控制CRISPR基因编辑

剥夺Cas9的基本要素

Savage最初的研究目标是削减Cas9蛋白 - 实际上是剪切DNA进行基因编辑的“剪刀” - 最简单的部分,以获得最强大的基因编辑器。它越简单,就越容易使用并运送到细胞中。

“我们知道Cas蛋白质是复杂的,并且它们具有各种调节,这对于它们如何在细菌免疫系统中起作用至关重要,”他说。“我们工作的主要目标是驯服它们以供人类使用,并去掉与基因组编辑无关的不必要的东西。”

特别是,他想重新设计Cas9,以便更容易附加其他蛋白质。这将允许Cas9将具有多种功能的蛋白质携带到DNA上的正确位置。这些被称为融合蛋白,其有希望的变体可以改变基因表达,或者在称为碱基编辑的技术的情况下,以精确的准确度改变DNA中的一个碱基或核苷酸。

他用来重新设计Cas9的技术,称为圆形排列,从未尝试过像Cas9那样复杂的蛋白质。循环置换包括取Cas9蛋白的氨基酸串并切割它,切换两个片段的顺序,然后允许它折叠成新的3D配置。他这样做的所有可能的方法是将蛋白质切成两块。

虽然您可能认为这会完全破坏蛋白质,但在大约10%的情况下,新蛋白质仍然起作用,就像他只是以不同的方式重新排列蛋白质的亚基而不影响它们的功能。这可能有效,因为正如CRISPR-Cas9发明者Jennifer Doudna和她的同事们所表明的那样,Cas9蛋白复合物具有高度的灵活性,当它抓到引导RNA上时会移动,与DNA结合并移动到位以切割DNA链。

Savage目前正在探索一些Cas9重排,这些重排可能为融合蛋白提供更好的支架,使它们更接近它们靶向的DNA链。

在重新安排Cas9支架的过程中,他偶然发现,他重新连接两个蛋白质片段的方式产生了不同。

“当我们切割蛋白质并将旧片段移到蛋白质中的新位置时,系统对于将两个片段连接在一起的方式变得非常敏感,”他说。“我们意识到我们可以利用这种敏感性来设计蛋白质以获得蛋白酶识别位点。”

该研究表明,“我们并没有坚持大自然赋予我们的基因组编辑蛋白质,”他说。“这些蛋白质可以精心优化,变成自然界中没有的支架,但具有适用于人体细胞的特性。”

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